Lipo2000試劑的使用范圍較廣，它不僅可以用于質粒DNA轉染、siRNA表達載體、雙鏈核糖核酸dsRNA轉染, 以及RNA等核酸轉染，還可以用于文庫篩選的高通量轉染。對于細胞轉染Lipo 2000幾乎涵蓋了HEK293、CHO細胞、HeLa等190多種細胞系。本期內容一起來學習下Lipofectamine™ 2000瞬時轉染的實驗流程吧！

(一)細胞轉染前的準備:

因轉染效率依賴于細胞培養(yǎng)密度，而Lipo2000脂質體轉染試劑具有細胞毒性，使用時需確保高細胞密度進行，建議根據細胞生長速度提前種板并使用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，使轉染時細胞呈對數生長并達到80%-90%匯合，有助于獲得最高轉染效率和表達水平，且能最小化高轉染活性導致的細胞生長降低影響。（可通過預實驗觀察細胞對試劑毒性的耐受程度調整細胞密度。）

(二)DNA準備：

內毒素是影響轉染效率高低的因素之一，請務必使用無內毒素的試劑盒抽提質粒，獲得高純度的DNA，紫外可見光光度法測濃度并標記計算用量。（質粒純度：A260/A280 比值 (1.7-1.9)，越近 1.8 越好）

(三)轉染復合物制備：

血清會影響復合物的形成從而影響轉染效率，用無血清培養(yǎng)基(比如Opti-MEM)稀釋DNA和轉染試劑。DNA和Lipo2000的比例，絕大多數細胞系通常推薦1:2-1:3，建議比例見下表。

表：轉染試劑Lipofectamine2000與質粒的用量參照表

對于每個轉染樣品（以六孔板為例），按如下方步驟制備轉染復合物:

1) Lipo2000稀釋液：取合適的EP管加入1500μl（250μl/孔） Opti-MEM，加入60μl（10μl/孔）Lipo2000混勻，室溫下靜置5分鐘。

2) DNA稀釋液：根據DNA的種類不同，分別于EP管中加入250μl/孔Opti-MEM，再加入4μg/孔質粒DNA輕輕混勻。

3) 將1)Lipo2000稀釋液以250μl/孔加入到2)各DNA稀釋液中，輕柔混勻，室溫靜置30min，形成DNA-Lipo2000復合物。

(四)轉染操作：

細胞在轉染前1小時左右更換新無雙抗無血清培養(yǎng)基。將制備好的DNA-Lipo2000復合物分別加入細胞培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)板輕輕搖動使復合物分布均勻。放入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48h，并在4-6h后更換wan全培養(yǎng)基。

(五)觀察：

如果轉染的是帶有熒光標簽的質粒，可以在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

(六)注意事項：

1)Lipo2000脂質體轉染試劑4℃保存，不可凍存。

2) Lipo2000脂質體轉染試劑避免長時間暴露在空氣中導致脂質體氧化而影響轉染效率。

3)有些無血清培養(yǎng)基(比如DMEM,CD293,SFMII,V-SFM等)稀釋DNA和轉染試劑時轉染效率有可能會降低。

4)Lipo2000脂質體轉染試劑不能渦旋、離心、暴力吹打，緩慢晃動混勻即可。

5)用量僅供參考，具體用量請根據細胞類型、鋪板密度等其他實驗條件進行優(yōu)化。

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