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產(chǎn)品簡(jiǎn)介
p24蛋白含量是檢測(cè)慢病毒物理滴度的常用方法。柏萊源（天津）生物科技有限公司作為譜新生物代理商，為您提供BlueKit系列即用型檢測(cè)試劑盒，該慢病毒滴度p24快速ELISA檢測(cè)試劑盒能在1小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出p24含量，方便快捷，合規(guī)穩(wěn)定性高，并提供優(yōu)質(zhì)服務(wù)保障。
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貨號(hào)：HG- P001L
在慢病毒載體制備的工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中,需關(guān)注病毒載體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立,包括病毒滴度、宿主細(xì)胞 DNA殘留、宿主細(xì)胞蛋白殘留。支原體等檢測(cè)指標(biāo)。測(cè)量病毒滴度對(duì)于病毒使用以及進(jìn)行感染細(xì)胞是至關(guān)重要的，也是慢病毒載體生產(chǎn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性(CQA)。滴度檢測(cè)包括物理滴度(病毒載體總顆粒數(shù))和轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度(病毒載體感染性顆粒數(shù))。物理滴度:載體特定蛋白/核酸的定量可用于載體顆粒數(shù)量(物理滴度)的估計(jì)。也即總顆粒數(shù)和基因組滴度表示病毒的物理數(shù)量,為物理滴度。例如，HIV-1衍生的慢病毒載體,可通過(guò) ELISA方法檢測(cè)病毒載體樣本中的 p24 蛋白從而進(jìn)行物理滴度的檢測(cè)，也可以通過(guò) qPCR 的方法檢測(cè)載體基因組 RNA拷貝數(shù)而實(shí)現(xiàn)物理滴度的檢測(cè)。
本試劑盒采用雙抗體夾心法(一種 ELISA 法)檢測(cè)供試品中的 p24總含量，通過(guò)換算，得到 p24 的物理滴度。使用預(yù)先包被有抗 HIV-1 p24 捕獲抗體的微孔板，反應(yīng)孔內(nèi)加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣本，同時(shí)加入抗 HIV-1 p24二抗，室溫孵育，形成抗體-抗原二抗復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，通過(guò) HRP 催化底物 TMB 產(chǎn)生藍(lán)色，終止后使用酶標(biāo)儀在 450 nm~630 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中 p24 含量。
檢測(cè)范圍:1.37 ng/mL~1000 ng/mL
96 T
適用于快速檢測(cè)基于HIV-1的慢病毒的p24蛋白含量測(cè)定。
| 組分 | 規(guī)格 | 存儲(chǔ)條件 |
|---|---|---|
| Coated Plate | 1×96 wells | 2 ~ 8℃ |
| Anti HIV-1 p24+HRP | 6 mL | 2 ~ 8℃ |
| HIV-1 p24 Standard | S1 ~ S7,S0 | 2 ~ 8℃ |
| Virus Lysis | 6 mL | 2 ~ 8℃ |
| Sample Diluent Buffer | 50 mL | 2 ~ 8℃ |
| 10×PBST Wash Buffer | 50 mL | 2 ~ 8℃ |
| Color Reagent | 12 mL | 2 ~ 8℃ |
| Stop Solution | 12 mL | 2 ~ 8℃ |
| Plate Sealer | 5張 | 2 ~ 8℃ |
| Instructions for Use （IFU） | 1份 | 2 ~ 8℃ |
所有試劑在2 ~ 8℃條件下有效期為12個(gè)月，開(kāi)封后，未使用完的試劑盒，仍在規(guī)定儲(chǔ)存條件下保存。
實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)準(zhǔn)備好下列試劑、耗材與設(shè)備：
◆?生物安全柜
◆?酶標(biāo)儀（至少配備450nm和630nm波長(zhǎng)）
◆?各規(guī)格移液器（如1000 μL，200 μL，10 μL等）
◆?渦旋儀
◆?吸水紙
◆?恒溫振蕩孵育器
◆?1000 μL，200 μL，10μL 等低吸附槍頭
◆?離心機(jī)
◆?去離子水
總時(shí)長(zhǎng)約1小時(shí)
| 組分 | 用量（μL） |
|---|---|
| DNase I | 1 |
| 10X Reaction Buffer with MgCl2 | 2 |
| RNase Inhibitor | 0.5 |
| 無(wú)酶去離子水 | 12.5 |
| 供試品 | 4 |
1. 打開(kāi)生物安全柜紫外燈，照射30分鐘。
2. 試劑盒提前從2-8℃冰箱取出后，于室溫放置至平衡（30分鐘及以上），保證本次實(shí)驗(yàn)檢測(cè)所需試劑。試劑盒開(kāi)啟時(shí)要標(biāo)注開(kāi)啟日期，優(yōu)先使用先開(kāi)啟的試劑盒，同一批號(hào)試劑盒可以混用，不同批號(hào)試劑盒不可混用。準(zhǔn)備本次實(shí)驗(yàn)所需要的Coated Plate，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書(shū)要求于2 ~ 8℃保存，以備下次使用。
3. 洗滌液配制：用去離子水將10×PBST Wash Buffer 稀釋至1×Wash Buffer，混勻，即得。
4. 供試品溶液配制：供試品的稀釋需在生物安全柜內(nèi)操作，使用Sample Diluent Buffer進(jìn)行稀釋。供試品稀釋或加樣前，確認(rèn)供試品已溶解并平衡室溫，操作前使用90%體積量程的移液器連續(xù)勻速吹打混勻20次或低速振蕩混勻，待供試品樣本充分混勻后使用。稀釋倍數(shù)可根據(jù)實(shí)際濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。注意：?jiǎn)尾较♂尡稊?shù)不應(yīng)高于10倍。
5. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度確認(rèn)：
| HIV-1 p24 Standard | 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL） |
| S1 | 1000 |
| S2 | 333.33 |
| S3 | 111.11 |
| S4 | 37.04 |
| S5 | 12.35 |
| S6 | 4.12 |
| S7 | 1.37 |
| S0 | 0 |
6. 內(nèi)控溶液配制（200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品）：取80 μL Sample Diluent Buffer，加入1000 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)品（S1）20 μL，混勻即得。
7. 加標(biāo)質(zhì)控溶液配制：取供試品溶液20 μL，加入20 μL 的200 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，即得。
8. 陰性對(duì)照樣本：取Sample Diluent Buffer直接檢測(cè)。
9. 加樣板布局（僅供參考，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)實(shí)際需要進(jìn)行調(diào)整）：
| / | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | SO | SO | S#01 | S#01 | S#09 | S#09 | S#17 | S#17 | S#25 | S#25 | S#33 | S#33 |
| B | S7 | S7 | S#02 | S#02 | S#10 | S#10 | S#18 | S#18 | S#26 | S#26 | S#34 | S#34 |
| C | S6 | S6 | S#03 | S#03 | S#11 | S#11 | S#19 | S#19 | S#27 | S#27 | S#35 | S#35 |
| D | S5 | S5 | S#04 | S#04 | S#12 | S#12 | S#20 | S#20 | S#28 | S#28 | S#36 | S#36 |
| E | S4 | S4 | S#05 | S#05 | S#13 | S#13 | S#21 | S#21 | S#29 | S#29 | S#37 | S#37 |
| F | S3 | S3 | S#06 | S#06 | S#14 | S#14 | S#22 | S#22 | S#30 | S#30 | S#38 | S#38 |
| G | S2 | S2 | S#07 | S#07 | S#15 | S#15 | S#23 | S#23 | S#31 | S#31 | ERC | ERC |
| H | S1 | S1 | S#08 | S#08 | S#16 | S#16 | S#24 | S#24 | S#32 | S#32 | NC | NC |
10.加樣：取出已平衡至室溫的Coated Plate，依次加入Virus Lysis，50 μL/孔；再分別加入HIV-1 p24 Standard 0 ng/mL、1.37 ng/mL、4.12 ng/mL、12.35 ng/mL、37.04 ng/mL、111.11 ng/mL、333.33 ng/mL、1000 ng/mL、供試品溶液、陰
性對(duì)照、加標(biāo)質(zhì)控溶液、內(nèi)控溶液，各10 μL/孔，平行2孔。
11.加酶標(biāo)二抗：每孔加50 μL Anti HIV-1 p24+HRP。
12.孵育：用封板膜封板后，放置恒溫震蕩孵育器中，調(diào)節(jié)參數(shù)，室溫18 ~ 25℃，500轉(zhuǎn)/分鐘，孵育30分鐘。
13.洗滌：在生物安全柜內(nèi)，小心揭掉封板膜，將板孔內(nèi)液體傾倒于廢液缸中，在事先準(zhǔn)備好的吸水紙上將板孔內(nèi)液體拍干，每孔加入300 μL 1× Wash Buffer，靜置30秒后，將板孔內(nèi)液體傾倒于廢液缸中，在吸水紙上拍干（確保孔內(nèi)無(wú)殘留液體），如此重復(fù)4次。
14. 顯色：加入Color Reagent，各100 μL/ 孔。此步驟需要在生物安全柜中避光操作（關(guān)閉照明）。
15. 孵育：用封口膜封板后置恒溫震蕩孵育器中，調(diào)節(jié)參數(shù)，室溫18 ~ 25℃避光孵育5 ~ 10分鐘。
16. 終止：孵育結(jié)束后，加Stop Solution各100 μL/孔，在25分鐘內(nèi)，用酶標(biāo)儀于450nm檢測(cè)波長(zhǎng)、630nm 參比波長(zhǎng)下讀取吸光度。
1). 供試品最終p24含量（ng/mL）計(jì)算公式
? 供試品最終p24含量（ng/mL）=稀釋倍數(shù)×四參數(shù)擬合供試品p24含量
2). 病毒顆粒數(shù)（PP/mL）計(jì)算公式
?病毒顆粒數(shù)（PP/mL）=供試品最終Lenti-p24含量×1.25×107
3). 內(nèi)控溶液回收率計(jì)算
回收率% = 內(nèi)控檢測(cè)濃度/內(nèi)控理論濃度 × 100%
4). 加標(biāo)回收率的計(jì)算
回收率% =（加標(biāo)檢測(cè)濃度×總體積）-（供試品檢測(cè)濃度×供試品體積）/加標(biāo)理論濃度 × 加標(biāo)體積 × 100%
1. 對(duì)于檢測(cè)值≥1.37 ng/mL的檢測(cè)復(fù)孔（包括標(biāo)準(zhǔn)品，加標(biāo)質(zhì)控樣品和檢測(cè)樣品），復(fù)孔OD CV值需≤20%；
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2 > 0.980；
3. 內(nèi)控溶液回收率為70% ~ 130%
4. 加標(biāo)質(zhì)控樣本的回收率在70% ~ 130%之間；
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現(xiàn)貨供應(yīng)：公司庫(kù)存充足，可快速發(fā)貨，減少用戶(hù)等待時(shí)間。
效期保障：嚴(yán)格把控產(chǎn)品質(zhì)量，確保試劑效期新鮮，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持：提供詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案和技術(shù)指導(dǎo)，幫助用戶(hù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，提高實(shí)驗(yàn)成功率。
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